1、.附件四【ZH】GPT2-1 指导原则：药物遗传毒性研究技术指导原则. .药物遗传毒性研究技术指导原则一、概述遗传毒性研究Genoto*icity Study是药物非临床平安性评价的重要容，它与其他毒理学研究尤其是致癌性研究、生殖毒性研究有着密切的联系，是药物进入临床试验及上市的重要环节。拟用于人体的药物，应根据受试物拟用适应症和作用特点等因素考虑进展遗传毒性试验。遗传毒性试验是指用于检测通过不同机制直接或间接诱导遗传学损伤的受试物的体外和体试验，这些试验能检出DNA损伤及其损伤的固定。以基因突变、较大围染色体损伤、重组和染色体数目改变形式出现的DNA损伤的固定，一般被认为是可遗传效应的根底，并且是恶性肿瘤开展过程的环节之一这种遗传学改变仅在复杂的恶性肿瘤开展变化过程中起了局部作用。在检测此类损伤的试验中呈阳性的化合物为潜在致癌剂和/或致突变剂，即可能诱导癌和/或遗传性疾病。由于在人体中已建立了*些化合物的暴露和致癌性之间的关系，而对于遗传性疾病尚难以证明有类似的关系，故遗传毒性试验主要用于致癌性预测。但是，因为已经确定生殖细胞突变与人类疾病有关，所以对可能引起可遗传效应的化合物与可能

2、引起癌症的化合物应引起同样的关注；此外，这些试验的结果可能还有助于解释致癌性的机制和试验结果。因此，在药物开发的过程中，遗传毒性试验的目的是通过一系列试验来预测受试物是否有遗传毒性，在降低临床试验受试者和药品上市后使用人群的用药风险方面发挥重要作用。本指导原则重点阐述遗传毒性试验体外试验的根本原则，并介绍标准试验组合方案，以及对试验结果的综合分析及评价。本指导原则适用于中药、天然药物和化学药物的遗传毒性试验研究。二、根本原则一实验管理药物的遗传毒性试验属于平安性评价研究，根据中华人民国药品管理法的规定，必须执行药物非临床研究质量管理规。二具体问题具体分析遗传毒性试验的设计，应该在对受试物认知的根底上，遵循具体问题具体分析的原则。应根据受试物的构造特点、理化性质、已有的药理毒理研究信息、适应症和适用人群特点、临床用药方案选择合理的试验方法，设计适宜的试验方案，并综合上述信息对试验结果进展全面的分析评价。三随机、对照、重复遗传毒性试验应符合毒理学试验的根本原则，即随机、对照和重复的原则。三、根本容一受试物1、中药、天然药物受试物应能充分代表临床研究受试物或上市药品，因此受试物应采用制备工艺

3、稳定、符合临床研究质量标准规定的样品，一般用中试样品，并注明受试物的名称、来源、批号、含量或规格、保存条件及配制方法等。如不采用中试样品，应有充分的理由。如果由于给药容量或给药方法限制，可采用原料药进展试验。试验中所用溶媒和/或辅料应标明批号、规格及生产厂家。2、化学药物受试物应采用制备工艺稳定、符合临床研究用质量标准规定的样品，并注明受试物的名称、来源、批号、含量或规格、保存条件及配制方法等，并附有研制单位的自检报告。所用辅料、溶媒等应标明批号、规格和生产厂家，并符合试验要求。二试验设计的总体考虑对药物而言，需对潜在的遗传毒性进展全面评价，遗传毒性试验可用作鉴定体细胞诱变剂、生殖细胞诱变剂和潜在的致癌物。目前，遗传毒性试验方法较多，所使用的生物材料多种多样，可以利用原核细胞到真核细胞直至高等哺乳动物细胞在体外进展添加或不添加代活化物的试验，也可在整体动物上进展体试验；根据试验检测的遗传终点可将检测方法分为三大类，即基因突变、染色体畸变、DNA损伤与修复；从试验系统来分，遗传毒性试验可分为体试验和体外试验。因体和体外试验差异较大，以下分别讨论体外试验和体试验的根本要求。由于体外的试验方

4、法均较多，本指导原则仅讨论常用方法及需要重点关注的问题，具体试验时需根据具体情况具体分析。1、体外试验根本要求1.1细菌回复突变试验中采用的根本菌株在细菌回复突变试验中至少应采用5种菌株，包括用于检测组氨酸靶基因中鸟嘌呤-胞嘧啶G-C位点碱基置换或移码突变的4种组氨酸营养缺陷型鼠伤寒沙门氏菌TA1535；TA1537/TA97/ TA97a注释1；TA98；TA100，以及用于检测组氨酸或色氨酸基因中腺嘌呤-胸腺嘧啶A-T位点碱基置换或移码突变的鼠伤寒沙门氏菌TA102或埃希氏大肠杆菌WP2 uvrA或埃希氏大肠杆菌WP2 uvrA pKM101注释2。由于检测G-C位点突变的4种菌株无法检测交联剂，因此检测交联剂时最好采用TA102菌株或增加一种修复准确型大肠杆菌如埃希氏大肠杆菌WP2 uvrA pKM101。1.2体外试验中最高浓度确实定注释3 体外试验中受试物的最高浓度主要取决于受试物对细菌/细胞的毒性和溶解度。1.2.1无毒化合物的高浓度对易溶解的无毒化合物，细菌试验应到达的最高浓度为5mg/皿，哺乳动物细胞试验为5mg/ml或10mM选用较低者。1.2.2要求到达的细胞毒性水

5、平在遗传毒性体外试验中，*些遗传毒性致癌剂只有在检测浓度高达可产生一定程度的细胞毒性时才可检出，但毒性过高又可影响对相应的遗传终点进展恰当的评价。当哺乳类动物细胞存活率很低时，一些遗传毒性以外的作用机制如细胞毒性如与细胞凋亡、溶酶体释放核酸切酶等有关的结果会导致遗传毒性的假阳性结果，这种情况常发生于受试物浓度到达毒性阈浓度时。鉴于以上情况，在体外细菌和哺乳类动物细胞试验中，目前可承受以下的细胞毒性水平浓度不应超过中的规定：1在细菌回复突变试验中，最高浓度应能显示明显的毒性，如回复突变数减少、背景菌斑减少或消失。2哺乳动物细胞体外遗传毒性试验中，毒性水平应高于50%细胞抑制率或细胞融合率，对培养的淋巴细胞，有丝分裂指数抑制率应高于50%。3哺乳动物细胞体外基因突变试验中，理想的最高浓度应能产生至少80%毒性即存活率不大于20%。可通过评价平板接种效率或相对总生长率测定毒性。对于细胞存活率低于10%时获得的阳性结果，应慎重对待。1.2.3难溶受试物的检测在用细菌和哺乳动物细胞遗传毒性试验检测*些受试物时，在不溶解的浓度围也能检测出剂量相关性的遗传毒性注释4。建议采用以下策略检测相对不溶的受

6、试物，该建议仅针对培养基中的受试物。1假设未观察到细胞毒性，应以产生沉淀的最低浓度作为最高浓度，但细菌试验不超过5mg/皿，哺乳动物细胞不超过5mg/ml或10mM。2假设观察到剂量相关性的细胞毒性或诱变性，则不管溶解度如何，应按上述要求的毒性水平来确定最高浓度，这需要检测多个产生沉淀的浓度。但当沉淀量影响到结果观察时，则无法到达所要求的细胞毒性的剂量水平。在给药处理开场前和完毕时，均应用肉眼评价沉淀量。1.3体外试验的重现性体外试验应关注重现性。体外试验通常应进展重复试验。但是，当采用标准的、已广泛应用的常规体外试验方法时，假设这些试验经过了充分验证且进展了有效的部质量控制，可不必进展重复试验，例如：对哺乳动物细胞基因突变试验，进展了规的围确定试验，其可提供足够的数据以保证试验方法的正确性；对体外染色体损伤的细胞遗传学试验和小鼠淋巴瘤tk试验，采用了适宜的、规的方法，如包括有阳性和阴性对照、加和不加代活化的试验、处理时间及采样时间适宜等。在进展这些试验后，假设得到明确的阳性或阴性结果，一般可不需要进展其他确证性试验；但假设得到可疑结果，则需要进一步试验。2、体试验根本要求2.1体试验

7、的给药途径一般情况下，给药途径应与临床拟用途径一致。假设不一致，应说明理由。2.2体检测染色体断裂剂的骨髓试验啮齿类动物骨髓有核细胞的染色体畸变试验可以检测多种染色体完整性方面的改变，该类变化几乎均来源于原发性的单个或多个染色单体断裂。如果产生了一个无着丝点片段，染色单体或染色体断裂就导致微核形成，因而检测染色体畸变或微核的方法可用于检测断裂剂注释5。由于细胞分裂后期的一个或多个染色体相对滞后也能形成微核，因而微核检测方法也能检测一些非整倍体诱导剂注释6。总之，体骨髓细胞染色体畸变试验或骨髓嗜多染红细胞微核试验均可用于检测断裂剂。此外也可以通过测定小鼠外周血中未成熟嗜多染红细胞的微核率来检测断裂剂，除小鼠外，也可采用其他脾脏无法去除带微核的红细胞或对断裂剂或非整倍体诱导剂有足够灵敏度的动物。2.3骨髓微核试验中啮齿类动物性别的选择对小鼠微核试验检测断裂剂的许多研究说明，通常雄性小鼠比雌性小鼠对诱导微核更敏感，二者之间仅有量的差异而无质的差异，但假设性别间存在显著的量的差异则会导致性别间的毒性不同。假设性别间代产物有明显的质的差异，则应采用二种性别的动物。类似的原则同样适用于其他体试验方

8、法注释7。骨髓微核试验可采用小鼠或大鼠。总之，在微核试验中，除非性别间在毒性或代方面有明显差异，一般单用雄性动物即可。如果受试物专用于一种性别，则通常选用相应性别的动物进展试验。三标准试验组合遗传毒性试验方法有多种，但没有任何单一试验方法能检测出所有的遗传毒性物质，因此，通常采用体外和体遗传毒性试验组合的方法，以减少遗传毒性物质的假阴性结果。这些试验相互补充，对结果的判断应综合考虑。1、标准试验组合应具备的特征标准试验组合应反映不同遗传终点，包括体和体外试验，从原核到真核细胞，因此应包含以下容：1应包含细菌回复突变试验，因为该试验已被证明能检出相关的遗传学改变和大局部啮齿类动物遗传毒性致癌剂。2因细菌不能完全检测DNA损伤，应采用哺乳动物细胞进展评价。目前使用的几种哺乳动物细胞系有：检测染色体损伤的细胞系染色体构造和数目畸变的体外试验；主要检测基因突变的细胞系注释8；检测基因突变与染色体断裂作用的细胞系小鼠淋巴瘤tk试验注释9。现有研究说明，对于检测具有遗传毒性但在细菌回复突变试验中结果为阴性的化合物，在采用适宜的试验方案条件下，检测染色体损伤的各种体外试验与小鼠淋巴瘤tk试验结果高度

9、一致。因此，在标准试验组合中，上述试验系统可互相替换。3应包含一项遗传损伤体试验，以提供一个包括影响受试物遗传毒性作用的其他相关因素吸收、分布、代、排泄的试验模型。体试验可另外检出*些遗传毒性物质注释10。可采用啮齿类动物造血细胞染色体损伤体试验或其他适宜的体试验。啮齿类动物染色体损伤体试验包括骨髓细胞染色体畸变试验和骨髓细胞或外周血红细胞微核试验。2、推荐的标准试验组合1一项体外细菌基因突变试验；2一项采用哺乳动物细胞进展的体外染色体损伤评估试验，或体外小鼠淋巴瘤tk试验；3一项采用啮齿类动物造血细胞进展的体染色体损伤试验。对于结果为阴性的受试物，完成上述三项试验组合通常可提示其无遗传毒性。对于标准试验组合得到阳性结果的受试物，根据其治疗用途，可能需要进展进一步的试验。建议采用标准试验组合并不意味着其他遗传毒性试验如DNA加合物检测，DNA链断裂、DNA修复或重组试验不适宜，这些试验可作为标准试验组合以外的供选试验，以进一步验证或补充标准试验组合得到的遗传毒性试验结果。此外，用分子生物学技术对遗传毒性作用机制进展研究，将有利于危险度评估。在*些情况下，标准试验组合中的一项或多项试验对受试物不适合时，可采用其他替代试验，但应提供充分的科学依据。标准试验组合不包括为检测非整倍体而设计的特定试验。但是，从体外和体染色体损伤试验中可得到非整倍体损伤的信息，如有丝分裂指数升高、多倍体产生和微核增加；小鼠淋巴瘤tk试验对于非整倍体诱导剂的检测也能提供一些有用的信息。出现上述情况时可

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